荧光定量PCR

      荧光定量PCR也叫Real-Time PCR，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其基本原理是在PCR体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或其他方法对未知模板进行相对或绝对定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

溶解曲线：

扩增曲线：

送样要求：

1.哺乳动物全血RNA提取样本前处理：取新鲜的全血（至少500ul），加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，4000rpm离心1分钟，彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每500μl全血收集的白细胞沉淀加入0.5ml Trizol，混合重悬沉淀，室温放置5min，使样品充分裂解，然后放-80℃冰箱保存或者干冰运输。

2.土壤样本：至少2g，液氮速冻，-80℃保存。（最好每个样本采集至少2管，每管2g以上的土壤样本，以备用）

3.动植物组织样本：迅速将新鲜的组织切成小于1cm3块状，装入2ml冻存管（动物组织样本）或15ml离心管（植物组织样本）在液氮中充分冷却（3-5min）后放-80℃冰箱保存。植物叶片，根系，茎 等组织至少100mg，含多糖多酚样本量增加到至少500mg）果实样本尽量提供1g以上，脂肪含量高的组织样本至少100mg。

4.细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每10E6细胞（大概6孔板一个孔的量）加入1mL Trizol，吹打混匀，收集裂解液-80℃储存；贴壁生长的细胞，先用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来并收集后，PBS充分洗涤细胞一次，再加入1mL Trizol进行细胞裂解，收集裂解液-80℃储存。

5.酵母，细菌，真菌样本：将培养好的酵母菌悬液离心收集菌体。菌体用预冷的PBS清洗一次，加入适量的Trizol或者酵母RNA提取液充分重悬菌体后放入-80℃保存。

6.RNA样品：总RNA（体积≥20μl，浓度≥100 ng/μl）；基因组DNA，cDNA不少于30 μg。

其他样本采样前可提前咨询。　

运输要求：

样本寄送和运输一律采用干冰运送。　

常用引物设计网址：

1. NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov；
2. The real-time PCR primer and probe database：http://www.rtprimerdb.org;
3. qPCR Primer Database: https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb;
4. PrimerBank: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank;

基因挑选和 相关性作图：

可关注诺敏科达公众号，参考公众号推文文章 实操｜转录组基因验证挑选原则及利用Excel制作相关性图

客户文章：